凝胶层析原理：分子筛效应如何实现物质分离？

凝胶层析（Gel Chromatography），又称凝胶过滤层析或分子筛层析，是一种基于分子大小差异分离混合物中各组分的液相色谱技术。其核心在于利用多孔凝胶介质作为固定相，当混合物流经层析柱时，不同大小的分子会因进入凝胶孔隙的能力不同而产生迁移速率差异：大分子无法进入孔隙，沿凝胶颗粒间隙快速流出；小分子则可进入孔隙，在柱内滞留时间更长，从而实现分离。该技术因操作温和、分离条件温和，广泛应用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的纯化、脱盐及分子量测定，是生物制药与生化研究中的基础分离手段。

凝胶层析中“分子筛效应”的具体作用机制是什么？

凝胶层析的“分子筛效应”是其分离机制的核心，本质上是凝胶介质三维网状结构与分子尺寸的相互作用结果。凝胶介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）内部具有大量均匀分布的微孔，这些孔径大小经过精确控制，形成类似“筛子”的结构。当待分离混合物随流动相（通常是缓冲液）进入层析柱时，混合物中的分子会根据自身尺寸与凝胶孔径的关系产生两种迁移路径：对于尺寸大于凝胶平均孔径的大分子，其无法进入凝胶颗粒内部的孔隙，只能沿着凝胶颗粒之间的间隙流动，因此迁移路径最短，最先从层析柱出口流出；而对于尺寸小于凝胶孔径的小分子，则可自由进入凝胶颗粒内部的孔隙，在孔隙中扩散并穿梭，实际迁移路径显著延长，导致其在层析柱内的滞留时间更长，最后流出；中等尺寸的分子则部分进入孔隙，滞留时间介于大分子与小分子之间。这种基于分子尺寸差异导致的迁移速率差异，使得混合物中不同组分得以按分子量从大到小的顺序依次分离。值得注意的是，分子筛效应的实现需满足两个关键条件：一是凝胶孔径分布需具有均一性，确保分离的可重复性；二是流动相需与样品及凝胶介质具有良好的相容性，避免非特异性吸附或相互作用干扰分离效果。

凝胶层析的介质选择对分离效果有哪些关键影响？

凝胶层析介质的选择直接决定了分离效率、分辨率及应用范围，是实验设计中的核心环节。介质的特性主要取决于其基质材料、孔径大小、颗粒粒径及物理化学稳定性，这些因素通过以下方式影响分离效果：

基质材料决定化学惰性与生物相容性：葡聚糖凝胶（如Sephadex）适用于水相体系，对蛋白质等生物大分子吸附性弱；琼脂糖凝胶（如Sepharose）具有更大的孔径范围，适合分离大分子如蛋白聚糖、病毒颗粒；聚丙烯酰胺凝胶（如Bio-Gel P）则在中性pH下稳定性高，但易在极端pH下降解。

孔径大小是分离分子量的关键参数：介质的“排阻极限”指不能进入孔隙的最大分子量，选择时需确保目标产物的分子量在介质的“分级范围”内——例如，Sephadex G-50的分级范围为1000-30000 Da，适合分离小分子肽段与蛋白质，若分离分子量超过50000 Da的蛋白质，则需选用G-100等更大孔径介质。

颗粒粒径影响层析柱的柱压与分离速度：小颗粒介质（如粒径40-60μm）比表面积大，分离分辨率高，但柱压较高，需用高压泵驱动；大颗粒介质（如100-200μm）柱压低，适合低压层析系统，但分辨率较低。

机械强度与化学稳定性决定使用寿命：高机械强度介质（如交联琼脂糖）可耐受较高流速，适合工业化生产；化学稳定性好的介质（如聚苯乙烯凝胶）可耐受有机溶剂，适用于非水相分离。若介质选择不当，可能导致目标产物与杂质分离不彻底（分辨率不足）、样品回收率低（介质吸附）或层析柱堵塞（颗粒破碎），因此需根据样品性质、分离目的及实验条件综合选择合适的凝胶介质。

如何通过凝胶层析测定生物大分子的分子量？

凝胶层析测定生物大分子分子量的原理基于“分子量-洗脱体积”之间的相关性：在特定凝胶层析系统中，分子的洗脱体积（Ve）与其分子量（M的对数，lgM）呈线性关系，通过绘制标准曲线即可未知样品的分子量。具体操作步骤如下：选择与待测样品分子量范围匹配的凝胶介质，并制备一系列已知分子量的标准品（如蛋白质标准品，包括细胞色素C、胰蛋白酶原、牛血清白蛋白等，其分子量覆盖目标样品的预期范围）。将标准品分别溶于与样品相同的缓冲液中，浓度约为2-5 mg/mL，确保检测信号在检测器线性范围内。随后，将层析柱（通常规格为1.6 cm×60 cm或2.6 cm×100 cm）用缓冲液平衡至基线稳定（流速控制为0.5-1 mL/min，避免流速过快影响分离效果）。分别进样标准品（体积一般为柱床体积的1%-5%），用紫外检测器（波长280 nm）监测洗脱曲线，记录各标准品的洗脱体积（Ve）。同时，需测定柱床体积（Vt，即凝胶介质完全溶胀后柱内液体总体积）和死体积（V0，通常用蓝色葡聚糖-2000等大分子标准品测定，其无法进入孔隙，洗脱体积即为V0）。计算各标准品的分配系数Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0），Kav值与lgM呈线性关系：lgM=a+b×Kav（a、b为常数）。以Kav为横坐标、lgM为纵坐标绘制标准曲线，线性相关系数（R2）需大于0.98以确保准确性。在相同条件下测定待测样品的洗脱体积Ve，计算其Kav值，代入标准曲线方程即可求得分子量。该方法操作简便、快速，且对样品活性影响小，但需注意：标准品与待测样品的分子形状需相似（如均为球蛋白），因为纤维状蛋白等非球形分子即使分子量相同，其洗脱体积也可能因形状差异而偏离标准曲线；缓冲液pH、离子强度及温度需与标准曲线测定条件一致，避免影响分子与介质的相互作用。

凝胶层析与其他层析技术（如离子交换层析）的主要区别是什么？

凝胶层析与离子交换层析、亲和层析等同为生物大分子分离技术，但分离机制、应用场景及操作特点存在显著差异。核心区别在于分离依据不同：凝胶层析基于分子尺寸大小进行分离，属于“尺寸排阻层析”（Size Exclusion Chromatography），分离过程中分子与凝胶介质无化学相互作用，仅受物理空间限制；而离子交换层析则基于分子表面电荷差异分离，属于“吸附层析”，通过带电分子与离子交换介质（如DEAE-纤维素、CMSepharose）的静电相互作用实现结合与洗脱。从分离原理看，凝胶层析的洗脱顺序固定——分子量大的先出峰，分子量小的后出峰，与样品组分性质无关；离子交换层析的洗脱顺序则取决于缓冲液pH和离子强度，需通过改变盐浓度（如线性梯度洗脱）逐步洗脱不同电荷强度的分子。在应用范围上，凝胶层析特别适合分离分子量差异较大的混合物，如蛋白质脱盐（去除小分子盐类）、缓冲液置换（更换样品所处的缓冲体系）及初步纯化（去除聚集体或降解片段）；离子交换层析则更适合分离电荷差异显著的分子，如带不同电荷的蛋白质同工酶、核酸片段（基于磷酸基团电荷）。操作条件也有差异：凝胶层析通常在温和条件下进行（中性pH、低离子强度缓冲液），对样品活性影响小，且上样量较大（可达柱床体积的5%-10%）；离子交换层析常需优化pH和离子强度以增强特异性结合，上样量相对较小（1%-5%），且洗脱过程可能需要高浓度盐溶液（如1 mol/L NaCl），可能影响后续实验。从分辨率看，凝胶层析的分辨率受介质孔径均一性影响，对分子量相近（如相差<10%）的分离效果有限；离子交换层析通过调节洗脱梯度，可实现对电荷差异微小分子的精细分离。综上，两种技术常联用：例如，先用离子交换层析粗分离电荷不同的组分，再用凝胶层析进一步分离分子量差异的亚组分，以提高纯化效率。